宝藏级深度数据挖掘：Dr. Tom + GSEA，一键分析，快速解读！

在转录组测序数据分析中，我们常常运用富集分析，将海量的基因数据从基因层面转化为功能层面，深入解析基因和表型之间的相互关系。

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为什么要使用基因集富集分析（GSEA）？

常用的富集分析方法主要有两种，传统的富集分析（Enrichment Analysis）及基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）。

传统的富集分析（通常为GO富集或KEGG富集）会针对所有的差异基因（DEG），通过超几何检验，找出显著富集的功能或通路。然而，这种方法有一个小问题：它只关注差异基因，可能会忽略那些表达变化不大、但对代谢通路有调控性影响的基因。另外，传统的富集分析仅反映差异基因的分布情况，没有考虑基因的表达量及变化趋势，基因是上调还是下调并不会影响富集的结果。所以，传统的富集并不能告诉我们具体的功能通路是被激活还是被抑制。

想要具体探究功能/通路的表现情况，我们可以使用GSEA。GSEA考虑了所有表达的基因在比较组中的差异表达情况，通过判断某一预定义基因集（即某一具体的通路/功能）中的大部分基因在比较组中是否发生了高表达/低表达，从而说明对应的功能是否发生显著变化，以及发生了怎样的变化（激活或抑制）。

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GSEA分析原理

在进行GSEA分析时，首先按照差异表达（通常采用Singal2Noise值，计算方法见下*）的由高到低对所有表达的基因进行排序，然后依次将基因与预定义好的基因集（即注释好的功能/通路）进行比较。若基因存在于该功能通路中，则得分，若不存在，则减分。当遍历完所有基因后，可绘制出该功能通路的得分曲线。以遍历过程中累计得分绝对值最大的分数作为功能/通路的富集得分（Enrichment Score, ES）。对ES进行显著性检验，获得名义P值（nominal p value）。对ES进行标准化处理，获得校正后的富集得分（Normalized Enrichment Score, NES）。对NES进行多重假设检验获得FDR值。

其中，μT为处理组各样本该基因表达量的平均值，μC为对照组各样本该基因表达量的平均值；δT为处理组各样本该基因表达量的标准差，δC为对照组各样本该基因表达量的标准差。

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GSEA官方数据库：MSigDB

那么，我们在做GSEA分析时，预定义的基因集从哪里来呢？

GSEA官方提供了一个注释数据库——MSigDB，其中收录了33,591个人的预定义基因集和16,063个小鼠的预定义基因集，并会不断进行更新。虽然其他物种的信息暂未收录，但我们仍然可以根据自己的需求使用其他的注释数据库（如GO、KEGG等）中的通路或功能条目作为预定义基因集，用GSEA的分析方法进行富集分析。

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GSEA分析工具使用

GSEA官网上提供了开源软件，用户可以自行下载使用。为了给我们的合作伙伴提供便利，我们在Dr. Tom多组学数据挖掘系统上提供了GSEA分析工具，可无限使用。通过简单的参数设置，则可快速进行GSEA分析。

在工具箱中选择GSEA工具，按照图示步骤定义好分析参数后，提交分析任务，可在系统上一键查看结果。

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GSEA结果查看及解读

Dr. Tom系统中，GSEA分析结果主要分为三个区域：功能/通路表、图区及对应的基因表格。

功能/通路表中包含各预定基因集对应的ES、NES、名义P值、FDR值等计算结果。

注意，功能/通路表区分了对照组和处理组，在处理组中的功能/通路，其ES为正值，说明该功能/通路在排序列表的顶部（在处理组中表达上调的基因）富集，该功能/通路在处理组中被激活；而在对照组中的功能/通路，其ES为负值，说明该功能/通路在排序列表的底部（在处理组中表达下调的基因）富集，说明这些功能/通路在处理组中被抑制。名义P值通常以P<0.05作为判断标准，P值越小，统计显著性越高；FDR通常以FDR<0.25作为判断标准，FDR越小，富集结果越可靠。当然，标准不是固定的，根据不同的课题背景及数据情况，阈值可适当调整。

在功能/通路表中点击对应通路的Figure按钮，图区会显示该功能/通路的分析结果。

领头亚集中的基因是对ES贡献最大的基因集合，当需要回归到基因层面的研究时可考虑优先关注这部分基因。ES值为正值的功能/通路，领头亚集位于ES对应排序的基因之前；ES值为负值的功能/通路，领头亚集位于ES对应排序的基因之后。

单击领头亚集区域，在基因表格中会展示领头亚集基因的信息，可以使用其他的可视化工具做进一步的挖掘，如绘制这些基因的表达量热图，通过PPI网络图寻找这些基因中的关键基因等。

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GSEA分析应用案例

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发表期刊：Molecular Cancer

发表时间：2022年

影响因子：17.794

摘要：环状RNA（circRNA）介导肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的浸润，以促进各种类型癌症的发生和发展，但在调节前列腺癌（PCa）巨噬细胞中的作用仍不确定。本研究首先通过RNA-seq、qRT-PCR等手段确定环状RNA circSMARCC₁为研究目标，并确认circSMARCC₁与小RNA miR-1322直接结合并抑制miR-1322的功能。而后研究circSMARCC₁在前列腺癌巨噬细胞调控中的具体机制。

实验设计：对过表达circSMARCC₁的前列腺癌癌细胞（DU₁₄₅-lv-circSMARCC₁）及前列腺癌癌细胞DU₁₄₅-vector进行转录组测序，比较基因表达的情况并做功能分析。

结果：与DU₁₄₅-vector相比，DU₁₄₅-lv-circSMARCC₁细胞中有151个基因上调，209个基因下调。KEGG富集及GSEA分析结果表明，PI3K-Akt通路发生富集，且与circSMARCC₁过表达呈正相关。circSMARCC₁通过激活参与细胞增殖和上皮间质转化的Akt通路，促进PCa进展。

注：文章中的富集分析及GSEA富集分析均在Dr. Tom多组学数据挖掘系统中完成。上文仅展示文章中部分结果。

目前，虽然GSEA分析方法在转录组数据的分析中的应用已经非常广泛和成熟，但传统的富集分析也并非无可取之处，在实际应用时应结合研究背景、研究目的、数据情况及分析结果综合判断，选择最适合的结果。

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撰稿：鱼

编辑：市场部

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